自宅で自分のDNAをシーケンシングする
(bradleywoolf.com)- 個人用機材でゲノムシーケンシングを試したい人向けに、頬粘膜細胞の採取からVCF解析まで続く実際のホームラボ手順と必要機材が一連の流れで整理されている
- 実験サンプルとして使う頬の内側の細胞は入手しやすいが、がん診断や特定組織の炎症・遺伝子発現解析のように組織コンテキストが必要な問いには適していない
- ゲノムデータの価値は即座に診断を受けることよりも、VCFを問い合わせ可能な参照レイヤーにしてVEP、ClinVar、gnomAD、PharmGKB、Gene Inspector、Claudeなどで変異を探索することにある
- 準備には約2か月かかり、MinIONだけでも約7,500ドルのため、機材・試薬・消耗品・解析環境まで考えると、まだ平均的な個人には費用障壁が大きい
- 低インプット・低カバレッジの実行は医療グレードの解釈ではなく技術検証として見るべきで、低カバレッジ変異を過剰解釈しない姿勢が重要である
ホームDNAシーケンシングの範囲と限界
- 自分のゲノムを Oxford Nanopore Technologies MinION で5回シーケンシングした経験に基づく
- 頬の内側の細胞を綿棒で採取する
- シーケンシング用サンプルとして準備する
- シーケンサーに載せる
- 結果データを解析する
- 頬粘膜細胞は簡単に採取できて速やかに補充されるが、あらゆる生物学的な問いに適しているわけではない
- がん診断には使わない
- 炎症の診断や、身体の別部位で活性化される遺伝子の確認には向かない
- 胸のじんましん部位の炎症細胞で発現する遺伝子を見たいなら、問題のある細胞と正常細胞を比較する必要がある
- 準備全体には約2か月かかり、費用はまだ平均的な個人がアクセスしにくい水準である
- 費用は下がりつつある
- 長期的には、携帯電話やAIのようにDNAやRNA発現をリアルタイムで知らせる技術が可能になると見ている
ゲノムデータでできること
- ゲノムは「魔法」ではなく参照レイヤーであり、VCFがあれば複数のツールで問い合わせられる
- 使えるツールには VEP、ClinVar、gnomAD、PharmGKB、Gene Inspector、Claude などがある
- VCFを基に次のような問いを探れる
- どんな変異を持っているか
- どの遺伝子や経路が影響を受けるか
- どの薬剤を異なる形で代謝する可能性があるか
- どの希少変異を真剣に見るべきか
- モデルがまだ把握していない領域はどこか
- 生成される情報はまだ診断レベルではない
- 「AIがそう言ったからCRISPRで自分を編集しろ」といった結論でもない
- 近い将来の価値は、静的なゲノムを問い合わせ可能な形に変えることにある
- DNAは安定した参照で、RNAは現在の状態により近く、長期的にはバイオセンサーデータを個人のひとつのモデルに統合できると見ている
必要な機材と消耗品
- 中核ハードウェアは Oxford Nanopore Technologies MinION で、価格は7,500ドル
- MinKNOWを実行するノートPCまたはワークステーション
- 出力保存用に100GB以上のストレージ
- Doradoベースコーリング用GPU
- Vortex、ヒートブロック、遠心分離機
- 主な消耗品にはONTシーケンシングキット、フローセル洗浄キット、対照物質、PBS、頬粘膜採取用スワブが含まれる
- 試薬はDNA抽出、ライブラリ調製、フローセルプライミング、定量測定に分かれる
- NEB Monarch HMW DNA Extraction Kit for Cells & Blood: 5回実行分で87ドル
- NEBNext Companion Module v2: 24反応分で760ドル
- Oxford Nanopore SQK-LSK114: 6反応分で720ドル
- nuclease-free water、Qubit fluorometer、Qubit dsDNA BR または HS Assay Kit
- ベンチ機器とプラスチック消耗品も別途必要
- microcentrifuge、magnetic rack、tube racks、ice bucket、-20°C freezer、4°C fridge、pipettes
- sterile cheek swabs、LoBind tubes、PCR tubes、Qubit assay tubes、filtered tips、wide-bore P200 tips、gloves
実験フロー: 採取から最終ライブラリまで
- 全体の目標は頬スワブサンプル2本をMinIONでシーケンシング可能なライブラリにすること
- 準備段階には手袋の装着、ベンチ清掃、チューブのラベリング、AMPure XP beadsの室温化、酵素の冷蔵維持、heat blockの56°C設定、ONT試薬の確認が含まれる
- 細胞採取と濃縮は、頬の内側を60秒間こすってPBSに入れ、遠心分離で小さな白色または灰白色のペレットを得る流れ
- PBSがやや濁ることがある
- ペレットを吸い込まないことが重要
- Monarchキットで細胞を溶解し、DNAをcapture beadsに結合させる
- 溶解後は高分子量DNAの保存が最優先なのでVortexは使わない
- DNAが結合したbeadsを失わないようにする
- gDNA Wash Bufferにはあらかじめethanolが加えられている必要がある
- 精製したgenomic DNAはQubitで定量する
- 1x dsDNA High Sensitivityを使う
- サンプル濃度が低すぎる場合は、新しいQubitチューブでより多くのDNAを使って再測定する
- 既存のチューブにDNAだけを追加するとassayの計算が崩れる
- 一時停止はDNA抽出直後が最も適している
- DNA LoBindチューブに明確にラベルを付ける
- quick spin後、Vortexせずに4°Cで冷蔵保存する
ライブラリ調製とフローセルローディング
- 理想的なrepair/end-prep入力は47µL中に1,000ngのDNA
- DNAが薄すぎて47µLに1,000ng入らない場合は、可能な最大容量を使う
- 最初の低インプット実行例は 0.296ng/µL × 47µL で約13.9ng であり、推奨入力よりはるかに低かったが、エンドツーエンドの練習としては有用だった
- repair/end-prepには FFPE DNA Repair Buffer v2、FFPE DNA Repair Mix、N-Prep Enzyme Mix を使う
- Salt-T4 DNA Ligase はこの段階ではなく後で使う
- DCSを使わない場合は optional 1µL DCS を nuclease-free water に置き換える
- AMPure cleanup後、adapter ligationでONTシーケンシングアダプターを付加する
- 反応には repaired/end-prepped DNA、LNB、Salt-T4 DNA Ligase、LA が入る
- LAを省くとシーケンシング可能なライブラリは作れない
- Salt-T4 DNA Ligaseを省くとアダプターligationは失敗する
- LNBを適切に混合しないとligation chemistryが悪くなる
- VortexはDNA shearingを起こしうるため避ける
- adapter-ligated library cleanupではethanolではなくLFBを使う
- 実務上のルールは「Liquid moves. Beads stay.」
- 最終ライブラリにはbeadsを移さない
- 最終ライブラリもQubitで再定量する
- 低インプット実行では値が低かったり失敗したりすることがある
- 練習実行では、Qubitにライブラリを繰り返し消費せず、12µL libraryでloading mixへ進められる
MinION実行とデータ処理
- MinKNOWでフローセルを確認し、active poresを記録する
- 1200個超: 良好
- 800–1200個: 使用可能
- 500–800個: 境界線上または練習用
- 500個未満: 良くはないが機械的な練習は可能
- 200個未満: ローディング練習以外では実質的な価値が低い
- 最終段階で扱うチューブは3種類
- Final library: アダプターcleanup後のDNA library
- Priming mix: フローセル準備用
- Loading mix: final library、sequencing buffer、library beads を含む
- フローセルのポートは2つ
- Priming port: sliding cover の下にあり、priming mix を入れる
- SpotON sample port: 小さな sample well で、loading mix を1滴ずつ入れる
- Final libraryはフローセルに直接載せず、まずloading mix tubeに入れる
- MinKNOWの基本設定は次のとおり
- Flow cell type: FLO-MIN114
- Kit: SQK-LSK114
- Basecalling: ON
- Model: High-accuracy / HAC
- Barcoding: OFF
- Alignment: OFF
- Adaptive sampling: OFF
- Raw reads / POD5: ON
- Filtering: 低インプットの練習実行ではOFF
- 低インプットの練習実行ではlive outputが良くなくても後で解析できるよう、raw POD5を有効にしておくことが推奨される
解析パイプライン
- 必要に応じて実行後にDoradoでbasecallingを行う
dorado basecaller sup pod5_directory/ > calls.bam- 必要なら
samtools fastq calls.bam > reads.fastqでFASTQに変換 - 迅速な一次確認にはSUPの代わりにHACを使える
- human referenceにはGRCh38 FASTAを使う
- minimap2でreference indexを作成する
map-ontでreadをアラインする- samtoolsでBAM indexとflagstatを作成し、mosdepthでcoverageを確認する
- 変異コールにはClair3とONTモデルを使う
- 出力にはVCFが含まれている必要がある
- 低coverage変異は過剰解釈しない
- 最初のMinION実行は医療グレードの解釈ではなく技術検証として扱う
- annotationではVEPをインストールし、GRCh38基準でVCFに注釈を付ける
- ClinVar、gnomAD、PharmGKBを追加する
- 最終テーブルには chromosome、position、ref、alt、gene、consequence、ClinVar significance、gnomAD frequency、genotype、read depth、variant quality が含まれる
参考資料
- Seth Howes protocol: 自宅でゲノムをシーケンシングする際の費用とプロトコルの参考資料
- Quantifying Life: 非常に過小評価されている資料として紹介されている
- Integrated Drug Discovery Technologies: 参考書籍として紹介されている
1件のコメント
Hacker Newsのコメント
自宅で直接シーケンシングしたいわけではないが、生データ一式を渡してくれる第三者サービスなら試してみたい。
欧州在住の一般消費者だが、どのサービスを使えばよいのかおすすめが知りたい。業者側でデータを保管しないなら大きな利点だが、そこまで求められるかは分からない。
23andMeの流出事例を参照: https://en.wikipedia.org/wiki/23andMe_data_leak
依頼すれば高解像度の全ゲノムシーケンシングもしてくれる。ただし時間がかかり、遅延に不満を言うと注文をキャンセルする権利を留保しているという。最安の選択肢ではないが、欧州人のプライバシーという観点ではかなり良いほうだと思う。プライバシーが重要であるほど、少し「付き合いにくい」業者のほうがむしろ良い場合もある。
彼は複数の国で実際にそうしてきたと言っていたが、人々が彼の肩書きのために助けてくれたのかはまだ分からない。それでも、ただのソフトウェアエンジニアでも手伝ってくれる人は見つかるはずだと確信していた。近くに研究所があるなら試してみる価値はある。
選んだ主な理由は、現在30ユーロの低価格商品があったからだ。
ロングリードが必要な理由は、欲しい情報がほぼ同一の重複遺伝子群の中にあるからだ。Dante Labsから受け取ったFASTQとBAMファイルはあるが、そこから欲しい情報を取り出すことはできなかった。
「AIが読むために作った文書なので、URLをコピーしてChatGPTに貼り付け、案内を受けるとよい。ARグラスがあればAIにプロトコル全体を追わせられるのでさらによい」という部分が、どんな魔法のような話なのか分からない。
自分で読んでもよいが、内容はかなり詰め込まれている。
下水管から根を引き上げ、必要ならシーケンシングでどの植物かを特定し、下水管が崩れる前に何を枯らすべきか教える会社を考えたことがある。
数年間、1万ドルの下水管交換を先延ばしにできるなら、100ドル払う人は多いと思う。
https://www.envirodna.com/
https://www.naturemetrics.com/species-detection
https://www.ednacollab.org/industry/
https://wilderlab.co/
こうした会社は環境DNAに注力している。一部は地方自治体のモニタリングに近く、一部は個人顧客も対象にしている。
なぜこれが必要なのかよく分からない。特定の植物を枯らす方法は、存在する可能性のある植物全体を対象にする方法よりどれほど優れているのか。複数種類の除草処理を組み合わせてもよさそうだし、その選択肢のほうがこのサービス費用より安いのではないかと思う。
本当に賢いアイデアで、条件が合えば確かにお金を払うと思う。
ただ考えてみると、生分解性の広域除草剤のようなものを排水口に流せば、もっと安く同じ効果を得られるのではないか。
十分な人数にサービスを知ってもらい、注文してもらうにはどうアプローチするのかが気になる。ここでは実用最小限の事業機会を考えさせられる。
100ドル未満で配管工に家のドアをノックさせることすら難しい。500ドルのつもりで言ったのか、それとも100ドルは実験室での分析部分だけを指しているのか気になる。
結果についての議論があるとよかった。このセンサーとプロセスに関する過去の報告は、評価がかなり分かれていた。
プロセス自体は格好いいが、実環境から得られた成果物がどれほど使い物になるのか知りたい。
https://www.the-odin.com/whole-genome-sequencing-30x/
速く、比較的安く済ませるなら599ドルの選択肢がある。
7,500ドル以上なら保証されたプライバシーを得られる。他の属性はコメントにあるように異なるかもしれないが、少なくともデータが家の外に出ることはない。
シーケンシングはしたいが、どんな企業、政府、宗教団体にも自分のデータへアクセスされたくない。
筆者が「VCF があれば VEP、ClinVar、gnomAD、PharmGKB、Gene Inspector、Claude のようなツールにかけられる」と述べているが、その場合、自分のデータが避けたいまさにその主体の手に渡るのではないか？
一方で Claude はデータを渡すことになるのは確かだ。ただし、その段階は必須ではない。標準的なパイプラインを回せば、ゲノム変異を含む VCF ファイルが得られ、各変異にアノテーションを付けられる。アノテーションされた遺伝子を確認し、その変異が病原性なのか、病原性の可能性があるのか、病原性が低いのか、良性なのかを判断できる。
手のひらサイズの物体でこういうことができるという事実は本当に驚きだ。同じくらいの大きさの CRISPR デバイス まで出てきたら、もはや Gattaca の筋書きになっていくので、ここで止めておくべきな気がする。
ウェットラボで DNA 採取とシーケンシングをした経験はあるが、ほぼ20年前のこととはいえ、この作業は難しく、失敗も多い。特に極めて清潔な環境がなければ、失敗はさらに増える。
データが得られた後でも、収集環境を考えたときにどれほど正確なのかを自問する必要があり、考慮されていない 相関したシーケンシングエラー も確認しなければならない。また、遺伝カウンセリングは実際に人々が学ぶ専門分野だ。遺伝子データが自分にとって何を意味するのかを大規模言語モデルに尋ねる前に、データを文脈化し、関連する専門家につないでくれる人にアクセスできるべきだ。この分野の博士号を持っていても、自分のデータを冷静かつ合理的に解釈できる自信はない。
付け加えると、Molecular Biology of the Cell のリンクが、4年前に出た第7版ではなく第6版なのはなぜか分からない。最初の3版は、私の最初の博士課程の指導教員が共著者で、彼は Roger Penrose が E. coli の走化性において微小管が重要だとしたアイデアが完全なナンセンスであることを示した人物だった。素晴らしい人だった。2007年に、商業的には非常に初期だった Illumina データを解析したことがあるが、参照ゲノムにアラインできたので、特定のバイアスを識別できた。ナノポア技術にはそのようなバイアスがさらに多い可能性が高く、それを考慮する能力がなければ大きな問題に直面しうる。
生化学の修士の立場から見てもそう思う。
個人向けゲノム企業の代わりに、研究室向けにシーケンシングの外注サービスを提供している会社に依頼する方法もある。解釈のリスクについては全面的に同意する。
プライバシーを意識している点は好ましい。「Claude にかける」という明白な問題を除けば、言及されている解析ツールのうち、どれだけが完全なオープンソース、または少なくとも ローカル実行 可能なのか気になる。
記事でその点を扱ってくれていたらよかったと思う。
自分が受け取った結果が本物なのか、それとも単なるゴミなのか、どうやって分かるのだろう？